DFG project G:(GEPRIS)405858350
Anti-Plasmid- und CRISPRi-Aktivität eines Typ IV-A CRISPR-Cas-Systems in Pseudomonas oleovorans
| Coordinator | Professor Dr. Lennart Randau |
| Grant period | 2018 - 2024 |
| Funding body | Deutsche Forschungsgemeinschaft |
| | DFG |
| Identifier | G:(GEPRIS)405858350 |
⇧ SPP 2141: Weitaus mehr als nur Verteidigung: die vielen verschiedenen Funktionen des CRISPR-Cas Systems ⇧
Note: Archaeen und Bakterien haben verschiedene Strategien entwickelt um Fremd-DNA abzuwehren. Eine dieser Strategien benutzt CRISPR-Cas Systeme, die ursprünglich als adaptive Immunsysteme gegen virale Angriffe beschrieben wurden. Cas-Proteine bilden Ribonukleoproteinkomplexe mit CRISPR-RNAs (crRNAs). Diese RNA-Moleküle enthalten sogenannte Spacer-Sequenzen, die Ziel-Nukleinsäuren über Basenkomplementarität erkennen können. In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass CRISPR-Cas-Systeme diesen RNA-Zielsuchmechanismus für andere Zwecke einsetzen können, da die Spacer-Sequenzen von CRISPR-Elementen dynamisch austauschbar sind und es in der Natur eine sehr große Anzahl funktionell unterschiedlicher Cas-Proteine gibt. Unsere Arbeitsgruppe untersucht zwei CRISPR-Cas Ribonukleoproteinkomplexe der Klasse 1, die sich durch einen reduzierten Cas-Proteinanteil auszeichnen. Zum einen analysieren wir einen Typ I-Fv Komplex aus Shewanella putrefaciens, dessen Ziel-DNA-Erkennung ohne die üblicherweise vorhandenen kleinen und großen Cas-Proteinuntereinheiten auskommt. Die Kristallstruktur dieses Komplexes legt nahe, dass besondere Domänen der Cas-Proteine Cas5fv und Cas7fv den Verlust dieser Untereinheiten kompensieren können. Wir beabsichtigen den genauen DNA-Zielerkennungsmechanismus dieses Komplexes zu untersuchen und die Bildung von crRNA-DNA-Interaktionen zu verfolgen. Dazu werden Biolayer-Interferometrie und Aktivitätsassays mit Cas-Proteinmutanten und veränderten Ziel-DNA-Sequenzen eingesetzt. In Kollaborationen mit anderen Arbeitsgruppen sollen die strukturelle und funktionelle Beteiligung der Helikasen Cas3 und DinG und die Dynamik der DNA-Zielerkennung analysiert werden.Des Weiteren wurde ein Typ IV CRISPR-Cas-System in Aromatoleum aromaticum identifiziert und rekombinante Typ IV Ribonukleoproteinkomplexe wurden produziert und aufgereinigt. Typ IV CRISPR-Cas-Systeme enthalten weder Adaptationsmodule noch erkennbare DNA-Nukleasen und ihre Funktion in der Zelle ist unbekannt. Die genaue Zusammensetzung des Typ IV-Komplexes soll mittels Größenausschluss-Chromatographie und Massenspektrometrie ermittelt werden. Die postulierte Abwesenheit einer DNA-Nuklease-Untereinheit weist auf eine CRISPR-Cas-Aktivität hin, die nicht auf dem Verdau von Nukleinsäuren beruht. Daher beabsichtigen wir die Bildung und Stabilität von Typ IV Komplex-vermittelten crRNA/DNA-Interaktionen in sogenannten R-Loops zu untersuchen. Dabei sollen R-Loop-Strukturen in vitro und in vivo mit Hilfe von Footprinting- und Bisulfit-Sequenzierungsmethoden detektiert werden. Die genetische Nachbarschaft von Transposons und Typ IV CRISPR-Cas-Systemen deutet auf die Möglichkeit von crRNA-gerichteter Transposition hin. Diese postulierte neue Funktion von CRISPR-Cas-Systemen soll durch Illumina-Sequenzierung analysiert werden, bei der die Mobilität von Transposons an durch CRISPR-Ribonukleoproteinkomplexen erzeugten R-Loop-Zielsequenzen verfolgt wird.
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