Record #299233 - GSI Repository

DFG project G:(GEPRIS)387150532

Gerichtete Evolution der Tryptophan Synthase alpha-Untereinheit zur Entwicklung eines C-C-knüpfenden Enzyms für die organische Synthese

Coordinator	Dr. Markus Dick, Ph.D.
Grant period	2017 - 2019
Funding body	Deutsche Forschungsgemeinschaft
	DFG
Identifier	G:(GEPRIS)387150532

Note: Die stereoselektive C-C-Bindungsknüpfung ist die wohl wichtigste Reaktion in der organischen Synthese, da das Grundgerüst aller organischen Verbindungen hauptsächlich aus Kohlenstoffatomen besteht. Daher ist die Entwicklung von neuen Katalysatoren für die Reaktion von großer Bedeutung. Als wichtige Alternative zu chemischen Verfahren haben sich in den letzten Jahren Biokatalysatoren entwickelt, welche u. a. durch günstige Herstellung, Umweltverträglichkeit und milde Reaktionsbedingungen hervorstechen. Jedoch ist die Anzahl der C-C-bildenden Enzyme für synthetische Anwendungen auf wenige Substratklassen limitiert. Daher soll in diesem Projekt ein neues Enzym etabliert werden, welches erstmals die Addition von Aldehyden an zyklische, ungesättigte Verbindungen katalysiert. Dieses Enzym ist die alpha-Untereinheit (TrpA) der Tryptophan-Synthase, welche in der Natur Indol-3-Glycerinphopsphat in Glycerinaldehyd-3-Phosphat und Indol (das als Substrat für die beta-Untereinheit dient) reversibel spaltet und somit die Rückreaktion in Syntheserichtung ermöglicht. Bisher wurde TrpA zwar mechanistisch untersucht, für eine biotechnologische Anwendung aber weder charakterisiert noch optimiert. Es ist Ziel des Projektes, die enzymatische Reaktion von Indolderivaten und Aldehyden zur Bildung von 3-(1-Hydroxyalkyl)-Indolen etablieren. Dies kann u. a. eine einfache Synthese von chiralen Bausteinen der großen Klasse der Indolalkaloide ermöglichen, welche die Grundlage zahlreicher biologisch aktiver Verbindungendarstellen.Ausgangspunkt sind dabei TpAs aus thermophilen Organismen, welche hitzetolerant und damit u. a. robuster gegenüber Veränderung sind. Zuerst soll die geringe Aktivität des isolierten Enzyms (ohne Komplexbildung mit der β-Untereinheit) für die natürliche Reaktion erhöht werden. Anschließendes Ziel ist die Erweiterung des Substratspektrum von TrpA. Dabei liegt im ersten Schritt das Ziel auf der Aktivitätserhöhung für nicht phosphorylierte Aldehyde, da die Phosphatgruppe für synthetische Anwendungen u. a. auf Grund der Instabilität von Nachteil ist. Darauf aufbauend wird das Substratspektrum von TrpA bezüglich Donor- und Akzeptormoleküle untersucht, und es sollen Enzymvarianten erstellt werden, welche ein breiteres Substratspektrum ermöglichen. Somit soll nachAbschluss ein Repertoire an TrpA Varianten zur Verfügung stehen, welches die stereoselektive Verknüpfung von Indolen an zahlreiche Aldehyde ermöglicht.Um die oben genannten Ziele zu erreichen, wurde die Methode der gerichteten Evolution ausgewählt, die es ermöglicht, über Zufallsmutagenese eine Vielzahl von TrpA-Mutanten zu erstellen, welche im zweiten Schritt z. B. bezüglich der Aktivität neuer Substrate getestet werden; die besten Varianten werden dann für weitere Mutationen ausgewählt. Unterstützend sollen Sequenz- und Strukturinformationen aus Literaturbeispielen (z. B. verwandte Enzyme, die für nicht-phosphorylierteAldehyde optimiert wurden) für einen rationalen Ansatz verwendet werden.

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Record created 2023-01-31, last modified 2024-09-28

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